一、涂片、干燥、固定、初染(媒染)、脫色、復染??
(1)?涂片:臨床標本或液體培養物可直接涂抹于潔凈的載玻片上,固體培養的細菌先在玻璃片上滴一滴生理鹽水,然后取菌少許在鹽水中磨勻,呈輕度混濁。涂好的菌膜大小一般以1cm2左右為宜。?
(2)干燥??涂片最好在室溫下自然干燥,或將標本面向上,置于酒精燈火焰高處慢慢烘干,切不可在火焰上燒干。?
(3)固定??細菌的固定常用火焰加熱法,即將上述已干的涂片在火焰中迅速通過3~5次,溫度以手能摸時熱而不燙為度。目的在于殺死細菌,凝固細胞質,改變細菌對染料的通透性。?
(4)?初染:不同的染色方法,所用染液也不同。染液以覆蓋菌膜為度。?
(5)?媒染:通過媒染可增加染料和被染物質的親和力。媒染劑還可用于固定之后,亦可含在固定液或染液中。?
(6)?脫色:此步驟主要目的是觀察細菌與染料間結合的穩定程度,作為鑒別染色之用。?
(7)?復染:細菌初染色被脫色后常以復染液復染,便于觀察。復染液的顏色與初染液有明顯不同。??

二、常用染料原液配制?
?一般制備100ml純酒精飽和溶液所需染料量:美蘭2g~5g;結晶紫7g~14g;堿性復紅3g~7g。??

三、常用的染色方法?
1、單染色法??即用一種染料染色的方法。常用呂氏美蘭或稀釋石炭酸復紅染液。?
染液?:①呂氏美蘭液,美蘭酒精飽和液30ml+0.01%KOH溶液70ml即成;②稀釋石炭酸復紅液??堿性復紅酒精飽和液10ml+5%石炭酸溶液90ml,然后用蒸餾水作10倍稀釋即成。?
2、菌種:大腸埃希菌普通斜面培養物。?
3、染色方法:于已做好的涂片上滴加呂氏美蘭或稀釋石炭酸復紅染液,染色1min,以水沖洗至無顏色流下為止,自然干燥或以遠火烘干后鏡檢。?????
4、結果:以美蘭染色者菌體呈現蘭色;以稀釋石炭酸復紅染色的菌體呈現紅色。?